DETECÇÃO DE BACTÉRIAS PATOGÊNICAS AO HOMEM EM BANDEJAS UTILIZADAS POR RESTAURANTES E LANCHONETES DA PRAÇA DE ALIMENTAÇÃO EM UM SHOPPING CENTER NA CIDADE DE PONTA GROSSA-PR



Nos dias de hoje, é grande a quantidade de pessoas que se alimentam "fora de casa" e é geralmente a falta de tempo e a pressa que as fazem procurar alimentos prontos em restaurantes self-service e até mesmo estabelecimentos de fast food. Devido a esse hábito da vida moderna as pessoas nem sempre se preocupam com a higienização correta dos utensílios utilizados para alimentação e do local em que estão fazendo suas refeições. Com o objetivo de avaliar a higiene sanitária dos restaurantes de um Shopping Center de Ponta Grossa-PR, foi realizada a coleta de dez estabelecimentos de alimentação para determinar se as bactérias isoladas são potencialmente patogênicas ao homem e determinar o risco potencial das bandejas como veículo de transmissão de doenças. Após as coletas, as amostras foram encaminhadas para o Laboratório Escola de Analises Clínicas Cescage (LEACC) onde foram isoladas as bactérias e em seguida levadas ao Laboratório Pontagrossensse de Analises Clínicas (LAPAC) para identificação das mesmas. Procedeu-se as analises microbiológicas para identificação das bactérias. Observou-se o crescimento de Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Escherichia coli e Klebsiella ozaenae. A presença desses patogenos reforça a necessidade de higienização correta das bandejas de forma a prevenir surtos de intoxicação alimentar devido a esses microorganismos. ABSTRACT Nowadays, there is a large amount of people who eat "away from home " and is generally a lack of time and hurry to make them ready to look for food self-service restaurants and even fast food outlets. Because of this habit of modern life people do not always worry about the correct cleaning of utensils used for food and the place where they make their meals. Aiming to assess the hygiene of the health of restaurants in a shopping center in Ponta Grossa-PR, was collected from ten eating establishments to determine if the isolated bacteria are potentially pathogenic to humans and to determine the potential risk of trays as a vehicle for disease transmission. After harvesting, samples were sent to the Laboratory School of Clinical Analyses Cescage (LEACC) where the bacteria were isolated and then brought to the Laboratory of Clinical Analysis Pontagrossensse (LAPAC) to identify these individuals. Proceeded to the microbiological analysis for identification of bacteria. We observed the growth of Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Escherichia coli and Klebsiella ozaenae. The presence of these pathogens reinforces the need for proper cleaning of the trays to prevent outbreaks of food poisoning due to these microorganisms. Key-words: contaminated trays, food habits, bacterial contamination, hygiene and sanitation, food contamination. INTRODUÇÃO Nos dias de hoje, é grande a quantidade de pessoas que se alimentam "fora de casa" e é geralmente a falta de tempo e a pressa que as fazem procurar alimentos prontos em restaurantes self-service e até mesmo estabelecimentos de fast food buscando sempre comidas, práticas, rápidas e econômicas. Esse fato colaborou para o aumento do número de estabelecimentos que fornecem opções para almoço e jantar dentre outras modalidades. Devido a esse hábito da vida moderna as pessoas nem sempre se preocupam com a higiene do local em que estão consumindo seus alimentos e os estabelecimentos por sua vez, ao se depararem com o grande fluxo de pessoas entrando e saindo, não se preocupando com a higienização correta dos seus utensílios de alimentação como as bandejas. Portanto, é necessário salientar que além dos aspectos de sabor, aroma e opções de pratos variados, há o aspecto sanitário e de segurança do consumidor que deve ser considerado. É por isso que bandejas são um dilema em quase todos os estabelecimentos, pois é difícil encontrar estabelecimentos que as lavem corretamente e o fato é que higienização deveria ser feito assim como os pratos, porque alimentos sempre caem nela fazendo com que haja proliferação de bactérias. Devido a isso, a preocupação com a segurança alimentar está crescendo cada vez mais visando sempre a saúde dos consumidores, onde a qualidade sanitária desses alimentos tornaram-se uma questão fundamental para controlar a transmissão de microorganismos através da alimentação. Relatos recentes da Organização Mundial da Saúde (OMS), informam que mais de 60% das doenças de origem alimentar, são de toxinfecções alimentares relacionados à deficiências de higiene ambiental, de utensílios e maus hábitos dos manipuladores. E dentre os agentes envolvidos, estão as bactérias, vírus, fungos e parasitos (PIMENTEL, 2010). Os riscos de uma intoxicação alimentar podem ir de uma simples diarréia, dor de cabeça, vômitos, mal-estar até estados mais graves como uma toxinfecção intestinal, paralisia muscular, problemas respiratórios e convulsões dependendo da qualidade e quantidade de microrganismos e toxinas ingeridas (GOMES, 2007). Portanto é imprescindível que as superfícies utilizadas para alimentação ou mesmo para preparo dos alimentos sejam mantidas em condições higiênicas adequadas. Com isso, para minimizar o risco de intoxicação alimentar, BRASIL (2002) implanta uma legislação sobre higiene sanitária onde obriga que todos estabelecimentos produtores/industrializadores de alimentos em todo o território nacional disponham de um Manual de Boas Práticas e de Procedimentos Operacionais Padronizados, a RDC 275, os quais devem abranger quesitos como a manutenção e a higienização das instalações, dos equipamentos e dos utensílios; o controle da água de abastecimento e da presença de vetores transmissores de doenças e de pragas urbanas; a capacitação dos profissionais; a supervisão da higiene dos manipuladores; o manejo correto do lixo e a garantia sobre a qualidade do alimento preparado. MATERIAIS E MÉTODOS COLETA DAS AMOSTRAS As amostras foram coletadas no mês de setembro em dez restaurantes do Shopping de Ponta Grossa ? PR, sendo estes escolhidos pelo maior movimento durante as refeições. Foram obtidas amostras de uma bandeja por estabelecimento e levadas até o Laboratório de Análises Clínicas Cescage (LEACC) para isolamento primário das bactérias e em seguida levadas ao Laboratório Pontagrossense de Análises Clínicas (LAPAC) para identificação das mesmas. MÉTODOS Coletou-se as amostras através de swabs umedecidos em salina, que após passados em toda região da bandejas, foram adicionados em tubos estéreis. Esses tubos foram então colocados em uma caixa de isopor e transportados até o LEACC. Fez-se no LEACC os isolamentos primários em técnica de semeadura por esgotamento, a partir dos swabs previamente coletados, nos meios de cultura Ágar Sangue e Ágar MacConkey. Estes meios foram incubados em estufa microbiológica por 24 horas, à 36°C Em seguida verificou-se o crescimento das colônias e transportou-se as placas, em caixa de isopor, até o LAPAC para identificação das bactérias. ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS 1 Análise morfológica das colônias. Primeiramente foram observadas as formas das colônias que cresceram nos meios de cultura onde, segundo Ribeiro; Soares (2002), no Ágar Sangue as colônias Gram positivas se apresentavam com tamanho médio de coloração esbranquiçada e colônias circulares e no Agar MacConkey as colônias Gram negativa se apresentavam nas mesmas formas, mas na cor rosa. 2 Coloração de Gram A partir da colônia isolada preparou-se um esfregaço para posterior coloração de Gram. A coloração de Gram é uma técnica de coloração de preparações histológicas para observação ao microscópio óptico, utilizada para corar diferencialmente microorganismos com base na composição química e integridade da sua parede celular (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005). Segundo Martins et. al. (2001), essa técnica segue a seguinte ordem: cristal violeta, lugol, álcool acetona e por fim fucsina, respeitando o tempo de ação de cada substância. 3 Identificação de Cocos Gram Positivos 3.1 Prova da catalase Em seguida, realizou-se o teste de catalase que caracteriza-se por colocar em uma lâmina uma amostra da bactéria que se deseja identificar em contato com uma gota de peróxido de hidrogênio (H2O2), para diferenciar Staphylococcus spp de Streptococcus spp e Enterococcus spp. Esse teste é utilizado para detectar a presença da enzima catalase que é produzida por Staphylococcus pela decomposição de peróxido de hidrogênio em oxigênio e água, que ocorre na maioria das bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas que contêm citocromo P450. Catalase positiva, há formação de bolha em cima da lamina, caso contrario é catalase negativa. 3.2 Prova da coagulase Posteriormente a Catalase fez-se o teste de Coagulase em todas as colônias que apresentaram resultado positivo no teste da catalase. Este teste tem por objetivo verificar ou não a presença da enzima Coagulase. Esta enzima ativa fatores de coagulação de plasma colhido com anticoagulante Citrato. O Staphylococcus aureus possui esta enzima. Após o preparo de uma suspensão a partir das colônias de Cocos Gram Positivos catalase positiva, incubou-se em estufa microbiológica, uma alíquota de 200¼l juntamente com plasma estéril de coelho colhido com citrato por 24h a 36°C, em tubo de vidro estéril. Ribeiro; Soares (2002), afirmam que em caso de formação de coágulo a bactéria em questão é da espécie Staphylococcus aureus. 4 Teste de Novobiocina Simultaneamente ao teste da Coagulase realizou-se o teste da Novobiocina para todos os cocos gram-positivo catalase positiva. Em caso de Coagulase negativa este teste serve para diferenciar as principais espécies de Estafilococos não produtores de coagulase. Este teste foi realizado fazendo-se a semeadura da bactéria em questão sobre uma placa de Agar sangue, com o auxilio de um swab estéril. Sobre esta semeadura colocou-se um disco de Novobiocina e a placa foi incubada em estufa microbiológica por 24h à 36°C. Após este período de tempo realizou-se a medida do halo de inibição, onde este ocorreu. Levi (2004) afirma que as amostras resistentes mostram zonas de inibição de 6 a 12 mm, e as mais sensíveis apresentam halos de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus saprophyticus são resistentes e as de Staphylococcus epidermidis são sensíveis. 5 Identificação de Enterobactérias As bactérias Gram negativa que cresceram no agar MacConkey, foram submetidas a testes para identificação utilizando-se o Kit para Enterobatérias da empresa NEWPROV®. Nesse estudo fez-se o seguinte procedimento: escolheu-se uma colônia isolada e, com auxílio de agulha bacteriológica flambada, recolheu-se uma parte da colônia. Inoculou-se no primeiro tubo por picada e estria na superfície deixando a tampa frouxa. Sem flambar, semeou-se o segundo tubo por dissolução, selou-se com vaselina líquida estéril e fechou-se bem a tampa. Ainda sem flambar, semeou-se o terceiro tubo com picada central única e deixou-se a tampa frouxa. No quarto tubo estriou-se a superfície e no quinto e ultimo tubo, repetiu-se o processo de diluição feito no segundo tubo, selou-se com vaselina e fechou-se bem a tampa (SOUZA, 2009). Incubou-se em estufa microbiológica por 24h à 36°C antes de se realizar as leituras e interpretações. Esses tubos contêm respectivamente: Tubo 1 ? MEIO DE EPM Permite a leitura das provas do LTD, Glicose, Gás e H2S. O LTD (desaminação do L-Triptofano) é evidenciado pelo desenvolvimento de cor verde-garrafa no ápice do tubo. A leitura da Glicose é feita pela observação de coloração amarela na base do tubo, com ou sem produção de gás, evidenciado pelo arrebentamento do meio ou a presença de bolhas. A produção de gás sulfídrico é verificada pelo aparecimento de cor negra (SOUZA, 2009). Tubo 2 ? MEIO DE LISINA Permite a leitura da reação de descarboxilação da L-Lisina. A cor amarela revela uma reação negativa e qualquer cor diferente de amarelo é considerado positivo (SOUZA, 2009). Tubo 3 ? MEIO DE MIO Permite a leitura das provas de Motilidade, descarboxilação da Ornitina e produção de Indol. A motilidade é observada pela turvação do meio; se houver crescimento somente na picada a prova é considerada negativa. A interpretação da Ornitina é semelhante à da Lisina, ou seja, cor amarela indica prova negativa e qualquer outra cor é considerada positiva. O Indol é revelado pelo acréscimo do reativo de Kovacs, após incubação de 24 horas: a formação de anel de cor vermelha significa que houve a produção de Indol, portanto prova positiva (SOUZA, 2009). Tubo 4 ? MEIO DE CITRATO DE SIMMONS Responsável pela leitura da prova de utilização do citrato como única fonte de Carbono. Meio de cor original verde, tornando-se azul em caso de prova positiva e permanecendo verde para provas negativas (SOUZA, 2009). Tubo 5 ? MEIO DE RHAMNOSE Permite verificar se o bacilo Gram negativo fermenta ou não este açúcar. Meio com cor original verde, tornando-se amarelo em caso de prova positiva e permanecendo verde para provas negativas (SOUZA, 2009). 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Das bandejas dos dez restaurantes analisados na presente pesquisa, apenas dois se apresentavam sem contaminação bacteriana em suas bandejas. em seis locais houve crescimento de bactérias Gram positiva e nos outros dois houve o crescimento de bactérias Gram negativa (Tabela 1). Tabela 1 - Total de amostras analisadas e resultados encontrados durante a coloração de Gram. Bactérias encontradas N° de estabelecimentos Porcentagem Nenhuma 2 20% Gram negativa 2 20% Gram positiva 6 60% Total 10 100% Fez-se então a coloração de Gram nas bactérias que cresceram no Agar Sangue da placa, resultando em cocos gram-positivos. A partir desse resultado, realizou-se a prova da catalase, resultando em catalase positiva, ou seja, Staphylococcus presente nas amostras. Posteriormente a catalase, fez-se o teste da coagulase, onde resultou em coagulase negativa, descartando-se então a hipótese de Staphylococcus aureus nas amostras. Seqüencialmente fez-se o teste da Novobiocina, onde identificou-se amostras com Staphyloccocus saprophyticus e Staphyloccocus epidermidis. Os meios de cultura e reagentes utilizados foram validados através de controle utilizando-se as cepas padrão Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228). Com as bactérias gram-negativas que cresceram no Agar MaConkey da placa, fez a identificação no minikit para enterobactérias, resultando em Klebsiella ozaenae e Escherichia coli. Dentre as análises microbiológicas realizadas, verificou-se que, em apenas dois locais não houve crescimento algum. Após a prova de catalase, colaração de gram e novobiocina observou-se que as bactérias gram positivas encontradas foram Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus saprophyticus. Em relação a identificação de enterobactérias, observou-se que as bactérias gram negativas existentes em apenas dois locais do shopping são Klebsilla ozaenae e Escherichia coli, (Tabela 2). Tabela 2 - Espécies bacterianas encontradas nos respectivos estabelecimentos após estudo de morfologia e características metabólicas. Amostras S. epidermidis S. saprophyticus E. coli K. ozaenae 1 + - - - 2 - + - - 3 + - - - 4 - + - - 5 - + - - 6 - + - - 7 - - - + 8 - - + - 9 - - - - 10 - - - - Total 2 4 1 1 Mendes et al. (2004), analisaram vinte e quatro bancadas de aço inoxidável em uma Universidade de Alimentação e Nutrição em Viçosa, MG, encontraram presença de 27% de Bacillus cereus. Pinto et al. (2004), analisaram cinqüenta amostras obtidas de superfícies, utensílios e equipamentos de cozinha, incluindo panelas, copos, colheres, bandejas, coador, mamadeiras e potes plásticos em um serviço de alimentação hospitalar em Viçosa, MG, onde foram encontradas bactérias do gênero Listeria, Salmonella e Klebsiella. Rossi (2006) analisou utensílios e equipamentos de nove restaurantes de Belo Horizonte-MG, onde foram observadas contaminações por Staphylococcus spp., Salmonella spp., coliformes totais e coliformes termotolerantes. Bodanesi; Fatel; Simm (2007) analisaram superfícies de utensílios e equipamentos de uma panificadora de Cascavel-PR, onde encontraram presença de coliformes fecais em 30% dos equipamentos, e 46% dos utensílios analisados. Feitosa et al. (2008) analisaram, no período de estiagem em 2007 e no período chuvoso de 2008, no Hospital Público de Morrinhos-GO, superfícies de utensílios e instrumentos tais como, bandejas, tesouras e pinças onde observou-se que os maiores índices de contaminação foram representados por E. coli e Enterobacter sp, ambos correspondendo a 25,59% e Proteus sp em 6,98% das amostras coletadas em 2007. E no período chuvoso de 2008, foram encontrados 32,56% de E. coli, e 2,3% de Salmonella sp e Klebsiella sp do total de amostras analisadas. CONCLUSÃO Na presente pesquisa realizada em bandeja, conclui-se que algumas se encontram em condições higiênicas inadequadas, evidenciada principalmente pela presença de enterobactérias, o que demonstra a importância desses utensílios como fontes de transmissão de microorganismos para os alimentos. A presença dessas bactérias reforça a necessidade de higienização adequada de forma a prevenir a ocorrência de surtos de intoxicação alimentar. Portanto, esses estabelecimentos que fornecem rotineiramente alimentos à população, devem proporcionar treinamentos aos funcionários garantindo assim condições absolutas de segurança higiênico-sanitária. É necessário, então, uma adaptação a RDC nº 275, de 21 de outubro de 2002 da ANVISA, e uma adequação imediata aos itens imprescindíveis que não foram atendidos para que haja uma melhor segurança ao consumidor. REFERÊNCIAS AKUTSU, R. C. et al. Adequação das boas práticas de fabricação em serviços de alimentação. Revista de Nutrição. vol.18 n.3. Maio/Junho 2005. ALVARENGA, A. et al. Avaliação dos fatores de risco associados á infecções por Staphylococcus sp. coagulase-negativo resistentes a oxacilina. Belo Horizonte. Instituto de Ciências Biológicas, 2000. ANDRADE, N. J.; SILVA, R. M. M.; BRABES, K. C. S. Avaliação das condições microbiológicas em unidades de alimentação e nutrição. Ciênc. agrotec., Lavras. v.27, n.3, p.590-596, maio/junho, 2003. Disponível em: . 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Autor: Camila Cardoso Gabriel De Souza


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