IDENTIFICAÇÃO DE MARCADORES RAPD LIGADOS AO GENE DE RESISTÊNCIA PARA A RAÇA 73 DE ANTRACNOSE EM FEIJÃO COMUM.
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma das maiores culturas alimentícias da América Latina (Sartorato e Rios, 1996). Todavia, tem ocorrido uma redução significativa da produtividade, em decorrência de doenças. No caso específico do feijoeiro, a antracnose, causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. e Magn.) Scrib., pode acarretar perdas de até 100% da produção se as condições ambientais forem favoráveis ao seu desenvolvimento (Singh et al. 1991). Além de diminuir o rendimento da cultura, esta doença deprecia a qualidade do produto por ocasionar manchas no grão, tornando-o impróprio para o consumo.
No Brasil, a antracnose é prevalecente nos principais estados produtores, como: Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Minas Gerais, Bahia e Pernambuco, sendo importante ainda nos estados do Espírito Santo, Alagoas, Sergipe e Paraíba (Rava et al., 1994). Rava et al. (1994) identificaram 25 raças de C. lindemuthianum, coletados em diferentes regiões. Estas raças foram identificadas e classificadas pela inoculação de 12 cultivares diferenciadoras (Pastor-Corrales, 1992).
O controle da doença pode ser alcançado pelo tratamento químico e a utilização de variedades resistentes (Sartorato et al., 1996). Os estudos relacionados com a resistência do feijoeiro à antracnose foram iniciados por McRostie (1919) com a descoberta do gene A (Co-1), na cultivar Michigan Dark Red Kidney e por Mastenbroek (1960) que identificou o gene Are (Co-2) na cultivar Cornell 49-242. Estes genes têm sido amplamente utilizados em programas de melhoramento tanto em nível de Brasil como em outros países.
O uso de cultivares resistentes constitui-se em uma estratégia mais comumente usada para o controle da antracnose do feijoeiro comum (Tu, 1983). A produção de uma cultivar que apresente resistência bem sucedida depende principalmente da compreensão dos níveis de variabilidade dentro e entre as populações do patógeno causador da antracnose (Rodríguez-Guerra et al., 2003). Assim, a estabilidade da resistência à antracnose em diversas cultivares é difícil de ser conseguida, pois em nível de campo existe uma relação direta entre a plasticidade genotípica do patógeno e a estabilidade de resistência do hospedeiro (Araya, 2003). Por esse motivo, embora o melhoramento para a resistência tenha criado diferentes variedades de feijão comum (Singh et al., 1992; Vidigal et al., 1997), novas cultivares têm que ser continuamente desenvolvidas em virtude desse alto grau de variabilidade patogênica do fungo.
Assim sendo, diversos estudos sobre a caracterização de genes de resistência presentes nas cultivares diferenciadoras foram elaborados e novos genes de resistência à antracnose em P. vulgaris foram identificados (Bannerot, 1965; Fouilloux, 1979; Adam-Blondon et al., 1994; Gonçalves-Vidigal, 1994; Young e Kelly, 1996a, 1996b, 1997; Young et al., 1998; Geffroy et al., 1999; Melotto e Kelly, 2000; Awale e Kelly, 2001; Alzate-Marin et al., 2001a; Alzate-Marin et al., 2003a, 2003b).
Existem genes de resistência à antracnose previamente caracterizados que apresentam locos complexos e ocorrem em séries alélicas, assim como, Co-1, Co-3 e Co-4 (McRostie, 1919; Fouilloux, 1979; Young et al., 1998; Arruda et al., 2000; Melotto e Kelly, 2000; Awale e Kelly, 2001; Alzate-Marin et al., 2003b; Gonçalves-Vidigal et al., 2003).
Nelson (1978) recomendou o uso de piramidação de genes como estratégia para o desenvolvimento de resistentes estáveis e para prevenir a eclosão de novos patótipos de um patógeno. Contudo, procedimentos de melhoramento tradicional são ineficientes para piramidação de genes resistentes devido à necessidade de múltiplas inoculações (Michelmore, 1995). Piramidação de genes resistentes usando marcadores moleculares permitiria uma seleção mais eficiente de plantas resistentes em populações segregantes. Atualmente, os RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) consistem em um dos marcadores moleculares mais usados em estudos genéticos. Esses marcadores são detectados pela amplificação, de forma arbitrária, de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos pela reação em cadeia da polimerase (PCR), na presença da enzima termoestável Taq DNA polimerase (Williams et al., 1990).
As principais vantagens do RAPD referem-se à fácil execução, rápida obtenção de marcadores, necessidade de pequenas quantidades de DNA genômico (10 a 100 ng), baixo custo, ausência de hibridação, não-utilização de radioisótopos. O polimorfismo é visualizado na forma de banda amplificada de DNA visível em gel de agarose, podendo ser detectado em regiões altamente repetitivas. Além disso, é possível a obtenção de um nível elevado de polimorfismo quando comparado com outros marcadores moleculares. As desvantagens relacionam-se à reprodutibilidade dos resultados, ambigüidade na interpretação das bandas, co-migração de fragmentos de igual ou tamanho muito próximo e ao caráter dominante da maioria dos marcadores obtidos (Ferreira e Grattapaglia, 1998).
Análises de polimorfismos de DNA com marcadores do tipo RAPD vêm sendo amplamente utilizados na identificação e seleção eficientes dos genótipos que carregam combinações específicas de genes de resistência (Haley et al., 1994b; Foolad et al., 1993). Marcadores RAPD ligados a genes de resistência têm sido identificados em vários trabalhos, tornando disponível o desenvolvimento de cultivares de feijoeiros resistentes a doenças, como antracnose (Adam-Blondon et al., 1994; Young e Kelly, 1994; Alzate-Marin et al., 1997), ferrugem (Haley et al., 1993b), mosaico comum (Haley et al., 1994a) e mancha-angular (Carvalho et al., 1997).
O objetivo proposto para esse trabalho foi estabelecer marcadores moleculares RAPD ligados a genes de resistência à raça 73 de C. lindemuthianum, presente no cultivar Widusa, a partir do cruzamento entre as cultivares diferenciadoras Cornell 49-242 (suscetível) e Widusa (resistente).
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Material genético e avaliação da doença
Plantas F2 originadas do cruzamento entre Cornell 49-242 e Widusa, foram inoculadas com uma suspensão de 1,2 x 106 esporos.mL-1 da raça 73 de C. lindemuthianum. Utilizou-se um compressor de ar tipo De Vilbiss, contendo a suspensão de esporos, a partir da adaptação do método empregado por Cárdenas et al. (1964). Após a inoculação, as plantas foram mantidas na câmara de nevoeiro por 96 horas, a uma temperatura de 20 ±2 ºC, com luminosidade controlada (12 horas de iluminação de 680 lux/12 horas de escuro) e aproximadamente 100% de umidade relativa. Após o período de incubação, as plantas foram transferidas para mesas, com temperatura 22 ±2º C, sob luz artificial, onde permaneceram até as avaliações. Entre oito e dez dias após a inoculação, foi realizada a avaliação visual dos sintomas em cada planta, utilizando-se uma escala de notas de 1 a 5 (Yerkes Jr e Ortiz, 1956). As plantas com notas 1 e 2 foram consideradas resistentes, e as que apresentavam notas 3 a 5 suscetíveis.
Com o intuito de identificar plantas F2 homozigotas resistentes para serem usadas nos bulks (grupos), plantaram-se sementes F3 de plantas F2 resistentes selecionadas. As F3 foram inoculadas e submetidas às mesmas condições descritas acima. Após sua avaliação selecionaram-se seis plantas resistentes da população F2 (com notas 1) e seis plantas suscetíveis (com nota 5), para compor os grupos de DNA de plantas resistentes e suscetíveis respectivamente.
2.2 Construção dos bulks (grupos de DNA)
Foi utilizado o método descrito por Michelmore et al. (1991) para análises de grupos (bulks) segregantes - Bulked Segregant Analysis (BSA), e cujo procedimento básico envolve a separação por diferenças entre duas amostras de DNA, derivadas de uma população segregante, originada de um cruzamento simples (Ferreira e Grattapaglia, 1995). A técnica de Análise do Bulks Segregante foi usada para identificar marcadores RAPD ligados a genes de resistência ao patótipo 73 de C. lindemuthianum. Dois bulks contrastantes foram preparados, cada um contendo DNA de seis indivíduos da população F2 homozigotos resistentes e seis homozigotos suscetíveis. Formados os grupos, os mesmos foram analisados pela técnica de RAPD para identificação de bandas heteromórficas.
2.3 Extração e amplificação do DNA
A extração do DNA total foi baseada na metodologia descrita por Edwards et al. (1991). Amostras de tecido foliar foram maceradas em tampão de extração de CTAB (CTAB 1%, Tris-HCl 1 M, EDTA 0,5 M e b-mercaptoetanol 1%). O DNA foi purificado com uma extração de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). O DNA foi precipitado com a adição de isopropanol gelado, seguindo-se por incubação overnight a ?20 oC. O pellet obtido foi ressuspendido em 1/10 de TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) contendo RNAase (20 mg/mL).
Amostras de DNA foram quantificadas, padronizadas para 10 ng e amplificadas pela técnica de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), de acordo com a metodologia recomendada por Young e Kelly (1996) usando primers aleatórios (Operon Technologies, Alameda, CA, USA.). Para a amplificação foram utilizados os primers AA-03, AA-12, A-09, A-18, B-12, C-08, F-16, G-19, M-12, Z-04.
A amplificação dos fragmentos com primers RAPD foi efetuada em um aparelho termoestável denominado termociclador MJ Research PT 100. As condições de amplificação foram as seguintes: 3 ciclos de 1 min/94 oC, 1 min/35 oC, 2 min/72 oC; 34 ciclos de 10 s/94 oC, 20 s/40 oC, 2 min/72 oC; 1 ciclo de 5 min/72 oC. Após o último ciclo de amplificação, a mistura de reação foi mantida durante cinco minutos a 72 oC e resfriada a 4 oC.
O DNA amplificado foi fracionado em gel de agarose 1,4%, preparado com brometo de etídio (20 mg/100 mL), em campo elétrico com 5 V.cm-1, durante aproximadamente três horas. O padrão de bandas produzido foi visualizado sob luz ultravioleta e as imagens captadas com um sistema de fotodocumentação.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram selecionados e testados, através da técnica de RAPD, indivíduos supostamente homozigotos quanto à resistência e suscetibilidade ao patótipo 73 de C. lindemuthianum. Análise morfológica demonstrou que a cultivar Widusa (P1), foi resistente à antracnose e Cornell 49-242 (P2) foi fenotipicamente suscetível. As populações segregantes (F2) foram agrupadas em bulks resistentes e suscetíveis (BR e BS, respectivamente), para avaliar a presença de marcadores moleculares.
Marcadores moleculares são polimorfismos na seqüência nucleotídica do DNA existentes entre indivíduos. Quando localizados próximos a genes de interesse (ligação gênica), a presença de tais polimorfismos pode ser utilizada para inferir a presença do gene devido ao fenômeno da co-segregação (Daryono e Natsuaki, 2002; Oliver et al., 2001; Wang et al., 2000). Marcadores moleculares do tipo RAPD ligados a genes de resistência a doenças, têm sido identificados em feijão (Young e Kelly, 1996 b; Alzate-Marin et al.; 1997, Carvalho et al., 1998). Dessa forma, o RAPD é um marcador útil para seleção de plantas com genótipo resistente.
Através da utilização dos oligonucleotídeos selecionados, foram evidenciadas bandas nítidas e reproduzíveis que variaram de 5 a 8, totalizando 42 loci estudados. O tamanho dos fragmentos amplificados permaneceu entre 500 pb e 1900 pb. O perfil eletroforético gerado pelos primers consistiu em 100% de bandas monomórficas, ou seja, não houve polimorfismo, que seria indício para um possível marcador molecular acoplado ao gene de resistência em questão.
Por se tratar de variedades de uma única espécie (P. vulgaris), as cultivares Widusa e Cornell 49-242 apresentam muitas regiões do genoma semelhantes e grande parte delas idênticas. Em decorrência dos primers RAPD serem construídos com seqüências arbitrárias e, em princípio, não se conhecerem as posições de homologia, suas seqüências podem ser coincidentes com regiões conservadas do genoma de Widusa e Cornell 49-242. A conseqüência seria pouco ou nenhum polimorfismo entre os indivíduos. A ausência de polimorfismo poderia estar igualmente associada à distância do marcador em relação ao gene de resistência. Quanto maior a distância do marcador ao gene alvo, menor a probabilidade de obter bandas específicas para o caráter resistência. Outra hipótese para a falta de bandas heteromórficas seriam possíveis eventos de recombinação meiótica.
A possibilidade de obtenção de marcadores moleculares ligados a genes de resistência deve continuar a ser investigada com outros primers e outras metodologias como a utilização de marcadores moleculares SCAR.
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Autor: Paula Silveira Perioto
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