Validação dos testes de coloração por sondas fluorescentes e de ligação a ovócitos criopreservados na avaliação de espermatozoides frescos e descongelados de jaguatirica (Leopardus pardalis)
Araujo, G.R.; Paula, T.A.R.; Deco-Souza, T.; Csermak Jr, A.C.; Alves, S.V.P.; Maruyama, M.M.F; Dornellas, W.S; Costa, P.H.C.
Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais e Animais Silvestres, Viçosa, MG, Brasil.
Introdução
Os principais programas de reprodução assistida com finalidade conservacionista incluem procedimentos para criopreservação de sêmen, que permitem a formação de bancos de germoplasma. Tais procedimentos, no entanto, imprimem uma série de danos à membrana e à fisiologia do espermatozoide, promovendo perda de viabilidade, mesmo com o uso de meios diluentes. A acurada avaliação da qualidade espermática é essencial para o desenvolvimento de protocolos mais eficientes e a predição da viabilidade fertilizante do sêmen descongelado. O uso de sondas fluorescentes ou fluorocromos isoladas ou em combinações possibilita uma análise criteriosa da integridade estrutural dos componentes dos espermatozoides, devido a sua característica de marcação estruturas específicas das células e detectar a integridade estrutural e funcional de forma clara. Embora o teste definitivo da viabilidade espermática seja a fertilização in vivo, testes de interação de gametas podem quantificar a capacidade ligante mimetizando assim a capacidade fertilizante in vitro. Deste modo, testes de interação entre gametas, homólogos e heterólogos, são de grande importância na avaliação de técnicas de criopreservação de sêmen. Neste sentido, objetivou-se validar o uso de combinação de sondas fluorescentes e teste de ligação à zona pelúcida de ovócitos heterólogos criopreservados na qualificação de sêmen frescos e descongelados de jaguatiricas.
Material e Métodos
Foram usados três machos de jaguatiricas adultos mantidos em cativeiro, sendo realizadas três coletas por animal com intervalo mínimo de duas semanas. O sêmen foi coletado por eletroejaculação conforme Ávila (2009). Foi comparada a avaliação espermática de rotina (vigor, motilidade, teste hiposmótico e patologia espermática), a avaliação da integridade da membrana plasmática e acrossomal utilizando sondas fluorescentes e o teste de ligação de espermatozoide em zona pelúcida de ovócitos de gata, no sêmen a fresco e descongelado. Foram adicionadas 2µl de Iodeto de Propídio (0,5mg/ml em DPBS), 10µl de Hoechst 33342 (25µg/ml em DPBS) e 60µl de FITC-PSA (100 µg/ml em DPBS) em microtubo contendo 10 µl do sêmen. O sêmen foi incubado por 8 min a 38°C, mantido sob escuro, e visualizado em microscópio de epifluorescência com filtro de excitação (365 nm) e filtro de barreira (410 nm) (Nikon®) nos aumentos de 400 e 1.000 vezes. Para o teste de ligação em zona pelúcida os ovários de gatas domésticas foram obtidos de ovariohisterectomia eletivas e congelados em soro fisiológico a - 20 °C até serem processados. Os ovócitos foram manipulados em meio Talp-Hepes modificado (Costa et al, 1997), desnudados segundo Costa (1994), e posteriormente colocados em poço com de 15 a 20 ovócitos por poço, com 400μl de meio TCM 199 modificado (Costa et al, 1997), e incubados em estufa a 38°C com 5% de CO2 e 95% de umidade relativa por 30 min, visando à estabilização das células. Cada poço recebeu 20μl de sêmen (0,5 x 106 espermatozoides móveis/ml), após 30 min de incubação foram adicionados 200μl de H342, após 50 min 20μl de IP e após 60 min os ovócitos foram lavados quatro vezes em meio Talp-Hepes modificado (Costa et al, 1997). Os ovócitos foram analisados em microscópio de epifluorescência (Nikon®) e todos espermatozoides ligados à zona pelúcida foram contados. O sêmen foi congelado a uma concentração final de 6% glicerol, 0,5% de Equex STM Paste® e 20 x 106 espermatozoides móveis/ml, envasados em palhetas de 0,25 ml, resfriadas a –0,55ºC/min, e congeladas a -5,8°C/min, posteriormente foram descongelados por imersão em água a 38oC por 7 s e em seguida foram avaliados da mesma forma que o sêmen a fresco. Os dados obtidos foram analisados quanto sua normalidade e homogeneidade. Aqueles dados que não atenderam às premissas de normalidade e/ou homogeneidade foram transformados e reavaliados. Os dados que atenderam às premissas de normalidade e homogeneidade foram submetidos à análise de variância pelo Teste F a 5% de significância. Os dados qualitativos (vigor) foram analisados pelo teste não paramétrico de Wilcoxon. As correlações entre e dentre tratamentos a fresco e descongelado foram obtidas por Correlação Simples de Pearson. As análises foram realizadas com uso do software SAEG 9.1 (UFV, 2007).
Resultados e Discussão
Tabela 1: Médias ± desvio padrão (coeficiente de variação) de parâmetros espermáticos de sêmen a fresco e descongelado de três jaguatiricas mantidas em cativeiro.
Sêmen a fresco
Sêmen descongelado
Vigor*
4,3±0,3a (6,2)
2,1±0,3b (16,7)
Motilidade espermática**
85,0±6,5a (7,6)
25,0±12,6b (50,3)
Patologias totais**
52,5±14,0b (26,6)
76,9±6,9a (9,0)
Defeitos maiores**
14,4±6,9b (50,7)
29,7±7,5a (25,3)
Defeitos menores**
38,1±8,6b (22,6)
48,4±12,4a (25,7)
Teste hiposmótico**
48,9±15,6a (32,0)
14,3±9,3b (65,0)
LI**
29,1±9,8a (33,7)
68,8±31,5b (45,8)
II**
70,3±9,2a (13,1)
13,2±8,3b (62,8)
LL**
0,6±1,5a (264,6)
3,7±4,6a (122,8)
IL**
0±0 (0,0)
0±0 (0,0)
TSO**
20,0 ±19,3a (96,9)
16,9 ± 18,0b (107,0)
*Colunas com letras diferentes diferem (P<0,01) pelo teste de Wilcoxon. ** Colunas com letras diferentes diferem (P<0,05) pelo Teste F. LI: Membrana plasmática lesada e acrossoma íntegro / II: Membrana plasmática e acrossomal íntegros / LL: Membrana plasmática e acrossomal lesados / IL: Membrana plasmática íntegra e membrana acrossomal lesada / TSO: Total de espermatozoides ligados na zona pelúcida de ovócitos
No presente trabalho, a associação das sondas IP, H342 e FITC-PSA mostrou-se eficaz para a distinção de diferentes populações de espermatozoides em um mesmo ejaculado. No entanto, devido ao reduzido tamanho do acrossoma de jaguatiricas, houve dificuldade em se identificar a coloração pelo FITC-PSA em associação com o H342. A análise da integridade morfofuncional da membrana plasmática e acrossomal demonstraram redução (P<0,05) da população II e um aumento na população LI no sêmen descongelado em relação ao a fresco, que foi inversamente proporcional à motilidade espermática entre estes dois tratamentos (Tab. 1). Em jaguatiricas do presente experimento foi observada correlação positiva da população II com o vigor (R=0,7; P<0,05), com motilidade espermática (R=0,9; P<0,05), além de correlação negativa (R=-1,0; P<0,05) com os defeitos maiores encontrados no sêmen descongelado. No sêmen descongelado a população II obteve correlação negativa (R=-0,7; P<0,05) com a patologia encontrada no sêmen a fresco. A população LI no sêmen a fresco obteve correlação negativa com o vigor (R=-0,7; P<0,05) e motilidade (R=-0,8; P<0,05), ambos a fresco, e correlação positiva com defeitos maiores no sêmen a fresco e no sêmen descongelado (R=0,7; P<0,05; R=0,7; P<0,05, respectivamente). Foi obtida correlação negativa da população LL no sêmen descongelado com a motilidade espermática do sêmen a fresco (R=-0,9; P<0,05) e correlação positiva com a patologia do sêmen descongelado (R=0,7; P<0,05). No presente experimento, houve uma redução (P<0,05) na quantidade de espermatozoides ligados entre o tratamento descongelado em relação ao sêmen a fresco (Tab. 1) e correlação positiva da quantidade de espermatozoides do sêmen a fresco ligados na zona pelúcida de ovócitos, com o vigor e motilidade espermáticos do sêmen descongelado (R=0,8 e R=0,8 (P<0,05)), sendo este teste interessante na predição da congelabilidade do sêmen.
Conclusão
A avaliação espermática com a combinação das sondas fluorescentes Iodeto de Propídio, Hoechst 33342 e FITC-PSA foi condizente com os resultados obtidos com os testes de rotina frente a amostras de sêmen de diferentes qualidades, com a vantagem de demonstrar de forma mais específica à localização das lesões celulares. Houve, no entanto, dificuldade em se identificar a população corada com a sonda FITC-PSA, dado o reduzido tamanho do acrossoma desta espécie. O uso de ovócitos criopreservados de gatas domésticas mostrou-se eficiente na quantificação da capacidade ligante de sêmen de jaguatirica em amostras de diferentes qualidades.
Bibliografia
Costa, E.P.; Vale Filho, V.R.; Nogueira, J.C. ; Sa, W.F. ; Costa, A.H.A. Técnica Simplificada Para o Desnudamento Rápido de Ovócitos de Bovinos. Arq. Bras. Med. Vet. Zoot., V.49, N.4, P. 425-432, 1997. Costa, E.P. Aspectos Morfológicos (Citológicos e Ultraestruturais) e Desenvolvimento de Ovócitos Bovinos In Vitro. 1994. 155f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.
